Tumor mutational burden als biomarker voor immunotherapie

29-03-2019 Pathologie

Tumor mutational burden, het totale aantal mutaties per coderend gebied van het tumorgenoom, is een relatief nieuwe kwantitatieve marker die behulpzaam kan zijn bij het voorspellen van de responsen op immunotherapie bij diverse typen kanker. Onderzoekers uit het Radboudumc (Nijmegen), het Erasmus MC (Rotterdam) en het Leids Universitair Medisch Centrum (Leiden) lieten er hun licht over schijnen tijdens de 13e bijeenkomst van de werkgroep Moleculaire diagnostiek in de pathologie.

Prof. dr. Michel van den Heuvel, hoogleraar Longoncologie in het Radboudumc, en prof. dr. Winand Dinjens, KMBP in het Erasmus MC, plaatsten tumor mutational burden (TMB) in een klinisch perspectief. Vorig jaar ging de Nobelprijs Geneeskunde naar respectievelijk de ontdekkers van de immuuncheckpointeiwitten CTLA-4 en PD-1. Remming van deze remmers van cytotoxische T-celactiviteit heeft gezorgd voor een therapeutische revolutie. In 2010 werd bekend dat het tegen CTLA-4 gerichte ipilimumab de overleving verbetert van uitbehandelde melanoompatiënten en inmiddels zijn ook tegen PD-1 gerichte antilichamen goedgekeurd (pembrolizumab en nivolumab), evenals een middel tegen het PD-1-ligand (PD-L1; atezolizumab).1
In 2015 werd duidelijk dat kankercellen met microsatellietinstabiliteit (MSI) veel tumorantigenen tot expressie brengen en ook vaak een relatief goede respons geven op immunotherapie.2,3 Een microsatelliet is een stukje DNA waarin een reeks van één tot zes nucleotiden een groot aantal keren achter elkaar voorkomt. Bij kankercellen waarvan de controle op replicatie beschadigd is (mismatch-repairdeficiëntie), is in veel microsatellieten, die verspreid in het genoom voorkomen, het aantal van deze reeksen veranderd.
Ook de TMB bleek bij diverse typen kanker voorspellend voor de respons op immunotherapie en inmiddels zijn de mutaties uitvoerig in kaart gebracht.3,4 Zo blijken kindertumoren relatief weinig mutaties te vertonen. Dan is er een middencategorie met 20-75 mutaties per tumor. Beduidend méér mutaties hebben longcarcinomen en melanomen (100-200 mutaties/tumor), veroorzaakt door respectievelijk UV-straling en tabaksrook (bij niet-rokers is de TMB tien maal lager). Bij MSI vindt men ruim 1.000 mutaties/tumor en bij uitval van de polymerase met proofreadingactiviteit ligt dat zelfs nog hoger. Bij genetische instabiliteit lopen de dochtercellen na elke celdeling weer nieuwe mutaties op.
Bij stadium IV niet-kleincellig longcarcinoom (NSCLC) is moleculaire analyse de basis voor de behandelkeuze, een benadering die volgens Van den Heuvel nog niet in alle Nederlandse ziekenhuizen wordt toegepast. De mutaties die de tumorcelproliferatie aanjagen (drivermutaties) zijn het geschiktst voor gerichte therapie - er zijn zo’n vijftien middelen op de markt en dat aantal neemt snel toe. Zijn er geen drivermutaties, dan kiest men voor PD-L1-gerichte immunotherapie. Is hiervoor een contra-indicatie, dan is chemotherapie de enige optie.

Klinische studies
TMB is bij immunotherapie slechts een van de responsvoorspellende factoren. Ook de tumor microenvironment (TME), met name de door de patholoog beoordeelde mate van inflammatie, is van belang, evenals de expressie van relevante moleculaire factoren. Dan is er de host environment: de erfelijke achtergrond van de patiënt en bijvoorbeeld ook de samenstelling van het microbioom, dat specifieke factoren produceert die ontstekingsreacties moduleren.
De eerste relevante studie die de rol van de TMB voor immunotherapie onderstreepte was CHECKMATE 026, waarin eerstelijnsbehandeling met nivolumab werd vergeleken met chemotherapie bij patiënten met PD-L1-positieve stadium IV-NSCLC.5 Weliswaar gaf nivolumab geen significant langere progressievrije overleving, maar die overleving was beduidend hoger bij een hoge TMB (evenals de responspercentages). Een vervolgstudie (CHECKMATE 227) combineerde nivolumab met ipilimumab en gaf een vergelijkbare uitkomst: ongeacht de mate van PD-L1-expressie (meer of minder dan 1%) was de progressievrije overleving significant langer na immunotherapie bij patiënten met een hoge TMB (tien of meer mutaties per megabase (Mb) DNA).6
Van den Heuvel wees er op dat voor deze studies verschillende TMB-tests werden toegepast. “De testontwikkeling gaat immers vaak langzamer dan de introductie van nieuwe behandelingen.”
Wanneer de PD-L1-expressie wordt uitgezet tegen de TMB, dan blijkt er geen enkel verband te zijn. Patiënten met een complete of partiële respons worden ook gezien bij een hoge TMB en lage PD-L1 en vice versa. De combinatie van beide biomarkers geeft wél een nauwkeuriger resultaat; daarmee kan een responspercentage van ruim 60% worden bereikt. Zijn beide negatief, dan heeft immunotherapie geen meerwaarde.
Volgens Dinjens is het bepalen van de TMB technisch redelijk gevalideerd (het is al in de ESMO-richtlijn opgenomen), maar een goede klinische validatie zou een prospectieve studie vereisen. De TMB geeft weliswaar een duidelijk signaal, maar het is nog onduidelijk hoe dat moet worden geïnterpreteerd. Waar op basis van TMB 30% van de patiënten in aanmerking komt voor checkpointremmers, is dat gecombineerd met PD-L1-positiviteit 10-15%. Aangezien het combineren van verschillende biomarkers de patiëntselectie nauwkeuriger maakt, ligt het niet in de verwachting dat prospectieve studies kunnen worden opgezet op basis van de TMB alleen - niveau 5-bewijs zal dus moeilijk te verkrijgen zijn.

Specifieke assays
Fearon en Vogelstein wezen er in 1990 al op dat de totale stapeling van genetische veranderingen van meer betekenis is voor het tumorgedrag dan hun volgorde. Dinjens: “Bij toename van de TMB is er gemiddeld ook een toename van voor immunotherapie noodzakelijke neo-antigenen, met als kanttekening dat bij een lage TMB er toch een sterk immunogene neo-epitoop aanwezig kan zijn, terwijl tumoren met een hoge TMB neo-antigenen kunnen presenteren die nauwelijks een immuunrespons opwekken. Uit een onlangs gepubliceerde analyse van 100.000 humane kankergenomen blijkt dat er in vrijwel alle tumortypen met een lage TMB incidentele gevallen zijn met een hoge TMB en die hebben in principe ook een goede kans op respons op immunotherapie.”7
TMB kan worden bepaald met whole genome sequencing (WGS; 3.000 Mb), whole exome sequencing (WES; 22.000 genen, 30 Mb coding DNA sequence (CDS)) of met een specifieke assay, zoals de FoundationOne CDx (324 genen, 0,8 Mb CDS, de klinisch best gevalideerde assay), MSK-IMPACT (468 genen, 1,22 Mb CDS), TruSight oncology 500 (523 genen, 1,94 Mb) of Oncomine TML (409 genen, totaal 1,7 Mb sequentie, waarvan 1,2 Mb CDS, niet goedgekeurd door de FDA). Deze laatste assay wordt toegepast door de groep van Dinjens: “We gebruiken routinepathologiemateriaal (biopten, paraffineblokjes, cytologiemateriaal) mits er voldoende tumorcellen aanwezig zijn. Enkele nanogrammen DNA is als uitgangsmateriaal al voldoende. Elk DNA-fragment wordt 600 keer gesequenced en samples kunnen worden gepooled. Uiteindelijk levert dit een overzicht van het aantal mutaties per Mb op. Ook kunnen we een analyse uitvoeren op copynumbervariaties (CNV: stukken DNA die ontbreken of te veel aanwezig zijn) en we krijgen ondersteuning van bio-informatici om uitkomsten te duiden. Interessant is overigens dat CNV een negatieve correlatie laat zien met de respons op immunotherapie.”8
Een in-silicovergelijking met 21.000 WES-data van ruim twintig tumortypen uit de COSMIC-database liet zien dat Oncomine TML niet onder doet voor WES.9 Wel zijn de uitkomsten enigszins gevoelig voor de toegepaste workflow, zoals bleek uit een vergelijkende analyse van vijf samples, uitgevoerd door de groep van Dinjens in samenwerking met dr. Paul Roepman, KMBP’er bij Hartwig Medical Foundation.

Implementatie in de diagnostiek
Dr. Leonie Kroeze, KMBP i.o. in het Radboudumc, ging in op factoren die van invloed zijn op de TMB-analyse, zowel wat betreft de tumormonsters en bewerking ervan (bioptgrootte, wijze van uitprepareren, wijze van fixeren, percentage tumorcellen, enzovoort) als de analyse van de data. Zo is inmiddels bekend dat het genpanel bij voorkeur meer dan 1 Mb moet omvatten om betrouwbaar de TMB te kunnen bepalen. Middels zo’n panel worden vele varianten gedetecteerd en vervolgens worden hieruit de somatische varianten gefilterd. Gezien de hoeveelheid varianten kan dit alleen met allerlei gereedschappen uit de bio-informatica. Een laatste filterstap stelt dan vast welke mutaties meetellen voor de TMB.
Kroeze concludeert dat met de TruSight oncology 500 (TSO500)-assay van Illumina tumoren met een hoge TMB goed zijn te onderscheiden van normaal weefsel en van tumoren met een lage TMB. “Voor zowel TMB- als MSI-bepalingen geldt dat de resultaten reproduceerbaar zijn. Bovendien zijn TMB-, MSI- en mutatiedetectie (eventueel met CNV- en translocatiedetectie) in één assay mogelijk.” Wel wijst ze er op dat er enkele aandachtspunten zijn met betrekking tot de TMB-analyse. De TMB-waarde kan worden beïnvloed door de DNA-kwaliteit en -hoeveelheid. “Daarnaast kan bij heterogene tumoren het tumorcelpercentage de TMB-waarde sterk beïnvloeden. Het is daarom van belang een minimale DNA-input, DNA-kwaliteit en tumorcelpercentage vast te stellen. En omdat de TMB-waarde kan variëren afhankelijk van de gehanteerde cut-offwaarden in de pipeline van de analyse, is standaardisatie noodzakelijk.”

Ook dr. Tom van Wezel, KMBP in het Leids Universitair Medische Centrum, wees op deze problematiek. “Het is lastig om de TMB als biomarker toe te passen, want er bestaat geen eenduidige manier om de TMB te berekenen. Er wordt een drempel gehanteerd van tien mutaties per Mb, omdat dit in de CHECKMATE 568-studie de beste correlatie bleek op te leveren. Deze studie gebruikte de FoundationOne CDx-test, maar die liet het in 40% van de gevallen afweten bij gebrek aan tumorcellen en/of DNA. Daarom hebben ook wij ons gewend tot de gevoeliger Oncomine TML-assay van Thermo Fisher Scientific. Deze test werkt goed, maar niet altijd en Van Wezel denkt dat de cut-offwaarde afhankelijk zal zijn van het tumortype. “Een hoge TMB in een sample zonder bekend DNA-reparatiedefect is zeker nuttige informatie en daarom zal het testen op TMB zeker worden ingevoerd. Aanbod genereert vraag. Maar eerst moeten alle ins en outs goed zijn uitgekristalliseerd!”

Referenties
1. Hodi FS, et al. N Engl J Med 2010;363:711-23.
2. Le DT, et al. N Engl J Med 2015;372:2509-20.
3. Rizvi NA, et al. Science 2015;348:124-8.
4. Vogelstein B, et al. Science 2013;339:1546-58.
5. Carbone DP, et al. N Engl J Med 2017;376:2415-26.
6. Hellmann MD, et al. N Engl J Med 2018;378:2093-104.
7. Chalmers ZR, et al. Genome Med 2017;9:34.
8. Davoli T, et al. Science 2017;355. pii: eaaf8399.
9. Chaudhary R, et al. Transl Lung Cancer Res 2018;7:616-30.

Dr. Jan Hein van Dierendonck, wetenschapsjournalist

Oncologie Up-to-date 2019 vol 10 nummer 2