De bepaling van de minimale residuele ziekte bij hematologische maligniteiten is aan verandering onderhevig. Zo zullen volgens de verwachtingen binnenkort nieuwe moleculaire en flowcytometrische technieken hun intrede doen. Moleculair bioloog dr. Peter Valk en medisch immunoloog dr. Vincent van der Velden geven alvast een voorzet ten aanzien van respectievelijk next generation sequencing en flowcytometrie.
De minimale residuale ziekte (MRD) die na behandeling van een hematologische maligniteit aanwezig is, heeft een belangrijke voorspellende waarde ten aanzien van de respons op behandeling en het ontstaan van recidieven. De manier waarop de MRD bepaald wordt, is sterk in ontwikkeling en omvat momenteel zowel moleculaire technieken als immunofenotypering door flowcytometrie. Voor patiënten met acute myeloïde leukemie (AML) zijn MRD-bepalingen verkregen via immunofenotypering reeds gevalideerd, onder andere in het laboratorium van dr. Vincent van der Velden van de afdeling Immunologie van het Erasmus MC te Rotterdam. Deze MRD-bepalingen worden reeds in de huidige therapieprotocollen gebruikt voor risico-indelingen. Moleculair bepaalde MRD wordt momenteel toegepast bij kinderen met acute lymfatische leukemie (ALL). De waarde bij volwassen patiënten met AML wordt momenteel in studieverband onderzocht, onder andere in het laboratorium van dr. Peter Valk. Hij is verantwoordelijk voor de moleculaire diagnostiek van de afdeling Hematologie van het Erasmus MC en verricht daarnaast onderzoek naar acute leukemieën.
Moleculaire technieken
De moleculaire technieken worden toegepast bij zowel de diagnostiek, de prognostiek als de bepaling van MRD. In het laatste geval betreft het met name bepalingen bij chronische myeloïde leukemie (CML), acute promyelocytenleukemie (APL) en pediatrische ALL. Tot op heden wordt MRD in principe bepaald met behulp van conventionele of kwantitatieve PCR (qPCR) voor specifieke genetische afwijkingen, zoals translocaties en mutaties. Het voordeel van de qPCR is dat men hiermee niet alleen heel gevoelig kan meten, maar ook het aantal leukemische cellen kan bepalen. Hierbij ligt de detectiegrens meestal tussen de 10-4 en 10-5. Door de enorme beweging in het moleculaire veld is naast qPCR ook next generation sequencing (NGS) een aantrekkelijke optie geworden. “Daarom hebben we er in ons laboratorium afgelopen jaar hard aan gewerkt om binnen de diagnostiek en prognostiek NGS te implementeren. In het geval van AML screenen we met NGS voor een aantal specifieke mutaties die bij AML frequent voorkomen en klinisch relevant zijn. Daarnaast blijkt uit de literatuur dat op NGS-gebaseerde MRD-bepalingen resulteren in een goede correlatie tussen het aantal leukemische cellen en het gemeten signaal”, aldus Valk.
De routinematige bepaling van MRD door middel van NGS vormt momenteel echter nog een uitdaging, omdat NGS hiervoor met een detectiegrens van tussen de 10-2 en 10-3 nog te ongevoelig meet. Daarnaast is NGS nu nog vrij kostbaar. Valk: “Het grote voordeel van NGS is dat je met deze techniek niet alleen naar gemuteerde hotspots kunt kijken, zoals bij qPCR, maar complete genen kunt sequencen. Daardoor kun je dus ook mutaties die buiten de hotspots liggen detecteren. Vanaf het moment dat tijdens diagnose bij een patiënt een mutatie is gevonden, kun je vervolganalyses tot die mutatie beperken en de gevoeligheid verhogen. Bovendien kun je met één NGS-run meerdere markers analyseren waardoor de MRD-detectie betrouwbaarder wordt. Daarentegen beperkt qPCR zich meestal tot de analyse van één marker per keer.”
Verschillen tussen maligniteiten
Niet elke hematologische maligniteit leent zich even goed voor de huidige moleculaire MRD-bepalingen. Bij myeloïde leukemieën vormt het, vanwege het heterogene karakter, bijvoorbeeld een uitdaging om voor elke patiënt een geschikte MRD-marker te vinden. Daarentegen kan MRD bij nagenoeg alle lymfatische leukemieën vaak zeer gevoelig bepaald worden met qPCR gericht op specifieke herschikkingen van de T-celreceptor- of immuunglobulinegenen. Door de toepassing van NGS kunnen we nu bij vrijwel alle AML patiënten mutaties vinden, die vervolgens weer als marker voor de MRD-detectie kunnen dienen.
Valk: “Op het moment zijn we in Rotterdam aan het onderzoeken of moleculaire MRD nauwkeuriger bepaald kan worden wanneer we de analyse van chromosomale afwijkingen door middel van PCR combineren met NGS van (een aantal) bekende markers. Ook in het kader van de HOVON-SAKK 132 AML-studie wordt hier aandacht aan besteed, bijvoorbeeld door het analyseren van follow-upmonsters. Door de karakterisering van veel nieuwe genetische afwijkingen hebben we voor die analyses 52 (potentiële) markers tot onze beschikking. Van zeven van deze markers is reeds bewezen dat ze bij AML prognostische waarde hebben. Met dit panel kunnen we naar schatting 80-90% van de patiënten vervolgen middels MRD-detectie.”
Niet alleen op het gebied van moleculaire markers is veel vooruitgang geboekt, ook ten aanzien van de apparatuur is het veld enorm in beweging. Valk: “Momenteel is er een beperkt aantal belangrijke producenten van NGS-apparatuur, maar dat beeld zal snel veranderen omdat een aantal nieuwe spelers binnenkort apparatuur op de markt zal brengen. Dat geeft een enorme dynamiek.”
Next-generationflowcytometrie
Naast moleculaire technieken kan ook flowcytometrie worden toegepast om MRD te bepalen. Volgens medisch immunoloog dr. Vincent van der Velden bestaan er tussen flowcytometrie en de moleculaire analyses echter wel essentiële verschillen op het gebied van bijvoorbeeld toepassingsmogelijkheden en technische uitdagingen. Van der Velden houdt zich onder andere bezig met de bepaling van MRD door middel van flowcytometrie. De implementatie van een nieuwe vorm van meten en analyseren, de next-generationflowcytometrie (NGFCM), vormt hier een onderdeel van.
NGFCM staat voor een nieuwe, meer gestandaardiseerde manier van flowcytometrie en benadrukt de vooruitgang binnen dit veld. Een van de gedachten achter NGFCM is dat door standaardisatie van protocollen, antilichamen, software en flowcytometers de enorme heterogeniteit binnen de diagnostische flowcytometrie wordt verminderd. “Op deze manier kunnen meetresultaten van patiënten en gezonde personen gemakkelijker met elkaar worden vergeleken en in een database verzameld. Met behulp van een dergelijke database kan vervolgens van een nieuw monster snel en betrouwbaar worden vastgesteld of het een afwijkende populatie bevat en met welke aandoening men dan te maken heeft”, legt Van der Velden uit.
EuroFlow
De aanpak van NGFCM is gebaseerd op die van het Europese EuroFlow Consortium bestaande uit twintig diagnostische centra en het bedrijf Cytognos. Dit consortium initieerde binnen Europa de standaardisatie van de flowcytometrie, bijvoorbeeld door de organisatie van workshops en de ontwikkeling van het analysesoftwareprogramma Infinicyt dat compatibel is met de meest gangbare flowcytometers. Ondertussen neemt ook in de andere continenten het aantal gelijkgestemden en gebruikers van Infinicyt toe. Het lijkt echter nog wel een uitdaging om ook binnen Nederland het aantal deelnemende centra uit te breiden. Momenteel maken het Erasmus MC en de Stichting Kinderoncologie Nederland te Den Haag deel uit van het EuroFlow Consortium en gebruikt een groeiend aantal diagnostische centra de analysesoftware.
Meer informatie
Een andere eigenschap van NGFCM is dat er veel meer kleuren – antigenen – gemeten kunnen worden dan vroeger. Van der Velden: “Momenteel worden er binnen de diagnostiek al standaard minimaal acht kleuren gemeten. Dit levert uiteraard veel meer informatie op over de geanalyseerde cellen en betekent daarnaast dat men nauwkeurig naar steeds kleinere subpopulaties, zoals bij MRD, kan kijken. Bovendien kan men in relatief korte tijd miljoenen cellen meten. Samen heeft dit wel tot gevolg dat de complexiteit tijdens de meting en gegevensanalyse toeneemt. Goede kwaliteitscontroles zijn dan ook van groot belang. Om dit te ondervangen heeft EuroFlow een rondzending in het leven geroepen waarmee centra kunnen controleren of hun protocollen en instellingen passen bij de EuroFlow-standaard.”
MRD-bepaling met NGFCM
Ten aanzien van de MRD-bepaling staat NGFCM nog in de kinderschoenen. Pas in 2014 werd deze toepassing als eerste bij volwassenen en kinderen met AML geïntroduceerd. Tot op heden worden de meeste flowcytometrische MRD-bepalingen echter volgens de klassieke methode uitgevoerd. “We zullen nu in de huidige protocollen moeten laten zien dat het ook op een andere manier kan en werkt. Binnen de vijf Nederlandse centra die de flowcytometrische MRD-bepaling bij volwassenen of kinderen met AML uitvoeren, zijn al acties in die richting ondernomen. Zo is de methode sterk geharmoniseerd en vinden er ook onderlinge gegevenscontroles plaats. Bovendien worden de metingen reeds met acht kleuren uitgevoerd wat bij dit complexe ziektebeeld resulteert in een gevoeligheid van rond de 10-3”, aldus Van der Velden.
Hoewel momenteel de op NGFCM-gebaseerde MRD-bepaling nog niet bij andere hematologische maligniteiten wordt toegepast, heeft Van der Velden hoge verwachtingen. In ieder geval zal de waarde van deze bepaling bij multipel myeloom binnenkort in het kader van een nieuwe HOVON-studie worden onderzocht.
In welke mate en bij welke ziektebeelden next generation sequencing en NGFCM in de toekomst aan de bepaling van MRD zullen bijdragen, is nu nog onduidelijk. De HOVON meldt in elk geval dat “gezien de overtuigende gegevens uit internationale studies, uitkomsten van MRD-bepalingen in HOVON-studies in de risicoclassificatie geïmplementeerd zullen worden.”2
Referenties
1. Van Dongen JJ, et al. Blood 2015;125:3996-4009.
2. Richtlijnen voor de diagnostiek en behandeling van AML. Te raadplegen via www.hovon.nl/behandeladvies/behandeladvies-leukemie/aml.html
Dr. R. van der Voort, wetenschapsjournalist
Oncologie Up-to-date 2015 vol 6 nummer 5