CRISPR-Cas9-screening zoekt naar nieuwe aangrijpingspunten voor immunotherapie

25-08-2019 Daniel Peeper2019, immuno

Wat kunnen fundamenteel en translationeel onderzoek betekenen voor de verbetering van immunotherapie? De uitdaging is om nieuwe aangrijpingspunten te vinden voor rationele behandelcombinaties. Volgens prof. dr. Daniel Peeper, hoofd van de afdeling Molecular Oncology & Immunology in het Antoni van Leeuwenhoek, Amsterdam, kan genoombrede CRISPR-Cas9-screening daar een belangrijke rol in spelen. Zijn onderzoeksgroep past deze betrekkelijk nieuwe technologie met succes toe om resistentiemechanismen bij immunotherapie te kraken.

Daniel Peeper geeft in het Antoni van Leeuwenhoek leiding aan een onderzoekslaboratorium dat zich richt op experimentele strategieën om genoombreed de functies van genen op te helderen die betrokken zijn bij therapieresistentie, en met name om de gevoeligheid van tumoren voor immunotherapie te verhogen. Hij werkt binnen het instituut nauw samen met internist-oncoloog prof. dr. Christian Blank. “We hebben hier een constructie dat een aantal clinici de helft van hun tijd kan vrijmaken voor research en om dat te ondersteunen is er een complementair samenwerkingsverband mogelijk met een fulltime onderzoeker. Dat twinningconcept heeft veel voordelen: voor basale en translationele onderzoekers wordt het eenvoudiger om toegang te krijgen tot klinische samples en inzicht te verwerven in behandelproblematiek, terwijl clinici toegang krijgen tot de nieuwste laboratoriumtechnieken en kennis van de laatste wetenschappelijke ontwikkelingen.”

Technologische vooruitgang
Een van die technische ontwikkelingen is de revolutionaire CRISPR-Cas9 genome editing, waarmee heel precies specifieke genen uit het genoom kunnen worden geknipt. “Als je de functie van een bepaald gen wilt bestuderen is het inactiveren ervan een krachtige methode,” legt Peeper uit. “Tot voor kort waren de bestaande technieken nogal omslachtig, maar de CRISPR-Cas9-methode heeft alles in een stroomversnelling gebracht. In principe zijn alle 25.000 menselijke eiwitcoderende genen al bekend, maar van lang niet alle kennen we de functie. Met technologieën die aan CRISPR-Cas9 vooraf gingen heeft mijn onderzoekgroep met name gezocht naar genen die betrokken zijn bij metastasering en resistentie tegen precisiemedicijnen. Tegenwoordig gebruiken we genetische screening met CRISPR-Cas9 in de context van tumorimmunologie. Van de circa twintig onderzoekers die in mijn laboratorium werken zijn de meesten bezig met deze screenings, ieder op een net iets andere wijze. Zo proberen we zowel het landschap in kaart te brengen van genen die de gevoeligheid van tumorcellen voor immunotherapie bepalen, als te zoeken naar manieren om T-celactiviteit te verhogen.”

Nieuwe precisiemedicijnen
Zo’n tien jaar geleden was chemotherapie met dacarbazine het enige wat artsen patiënten met gemetastaseerd melanoom konden bieden, een middel met weinig klinische impact. Toen verschenen er remmers van het BRAF-eiwit, dat bij bijna de helft van de melanoompatiënten door een mutatie is geactiveerd. De meeste patiënten respondeerden goed op die behandeling, maar hadden na gemiddeld een half jaar een resistent recidief. De volgende mogelijkheid die zich aandiende was een combinatiebehandeling met een remmer van MEK, een eiwit in dezelfde cellulaire signaleringsroute als het BRAF-eiwit. Dat gaf weliswaar een verlengde respons, maar bood geen oplossing voor het resistentieprobleem. Peeper: “We hebben hard gewerkt om die resistentiemechanismen op te helderen, wegen te vinden om ze te omzeilen. Maar parallel aan die ontwikkeling was er de eveneens baanbrekende immunotherapie, met name de immuuncheckpointblokkade met de antistoffen anti-PD-1 en anti-CTLA-4. Daar worden nu spectaculaire resultaten mee bereikt. Maar al is melanoom een van de best op checkpointremmers reagerende tumortypen, uiteindelijk is er nog steeds een aanzienlijke groep patiënten die geen langdurige respons heeft.”

Talloze resistentiemechanismen
Sommige tumortypen hebben weliswaar talloze DNA-afwijkingen die door immuuncellen herkend kunnen worden, maar ze vertonen wellicht daarom doorgaans ook genoeg genetische flexibiliteit om aan de immunotherapie te kunnen ontsnappen. “Vandaar dat we moeten nagaan of er aangrijpingspunten zijn om de resistente klonale subgroepen binnen zo’n heterogene tumor te vinden en aan te pakken. Er zijn meerdere moleculaire mechanismen die leiden tot resistentie tegen anti-PD-1, zoals mutaties in de signaleringsroutes van door T-cellen uitgescheiden interferon-gamma en in de verwerking en presentatie van antigenen door het MHC-eiwit van de tumorcel. Ze leiden allemaal tot onzichtbaarheid van de tumorcellen voor T-cellen. Er zijn echter ook tumoren waarin het tumorantigeen weliswaar naar behoren wordt gepresenteerd, maar waar T-cellen niet in staat zijn het tumorweefsel binnen te dringen; men spreekt dan van cold tumors of zelfs immune deserts. In tumoren met veel T-celinfiltraat zijn de T-cellen vaak onvoldoende of niet actief; de expressie van immuuncheckpoints als PD-1 of CTLA-4 is een krachtige strategie om de celdodende activiteit van T-cellen uit te schakelen, een fysiologisch systeem om auto-immuniteit te voorkomen.”

Technieken combineren
Tumoren reageren dus vaak niet op immuuncheckpointblokkade, en daar moeten nieuwe oplossingen voor worden gezocht. Omdat met name tegen PD-1 gerichte therapie zo effectief kan zijn, is de farmaceutische industrie bezig talloze studies op te zetten om anti-PD-1 te combineren met verschillende behandelingen, zoals bestraling, chemotherapie, precisiemedicijnen en alternatieve vormen van immunotherapie.1 Daar zit volgens Peeper echter niet altijd een heldere wetenschappelijke gedachte achter. “Bovendien - hoe gek het ook mag klinken - zijn er veel meer behandelcombinaties mogelijk dan er patiënten zijn. Daar ligt dus een mogelijkheid, en misschien wel verantwoordelijkheid, voor translationele onderzoekers. In mijn groep proberen we slimme technieken in te zetten om rationele behandelcombinaties te vinden. CRISPR-Cas9 is daar een goed voorbeeld van.
In combinatie met next generation sequencing, een tweede technologische vooruitgang, waarmee we nauwkeurig en snel grote DNA-sequenties kunnen bepalen, is CRISPR een krachtige strategie om nieuwe targets voor behandeling te vinden. De derde ontwikkeling vindt plaats in de bio-informatica, nodig om al die big data te verwerken en te analyseren. Vroeger zette ik zelf in het laboratorium hooguit twintig monsters op een DNA-gel en tegenwoordig krijgen mijn onderzoekers uit één experiment honderdmiljoen datapunten. Om bonafide signalen te onderscheiden van achtergrondruis heb je geavanceerde bio-informatica en statistiek nodig. Succesvolle CRISPR-Cas9-screening vereist dus een combinatie van al die technieken en uiteindelijk kunnen we zo heel efficiënt uit 25.000 menselijke genen enkele tientallen identificeren die betrokken zijn bij de gevoeligheid van tumorcellen voor cytotoxische T-cellen. Vervolgens kijken we of de expressie van die genen verandert nadat patiënten zijn behandeld met immunotherapie, een mogelijke indicatie dat de bewuste genen inderdaad betrokken zijn bij resistentie. Tevens gaan we na of er een medicijn voor beschikbaar is en zo niet, of we dat redelijk eenvoudig kunnen maken, zoals een antilichaam.
We hebben nog een lange weg te gaan, maar ik ben enorm enthousiast over deze technologische ontwikkelingen. En weet: CRISPR-Cas9 komt voort uit onderzoek aan bacteriën: een prachtig voorbeeld van het belang van basaal onderzoek voor medische vooruitgang!”

Referenties
1. Sharma P, et al. Cell 2017;168:707-17.
2. Vredevoogd DW, et al. Cell 2019;178:1-15.

Dr. Jan Hein van Dierendonck, wetenschapsjournalist

Immunoncologie.nl 2019 vol 3 nummer 2

Impact immunotherapie vergroten door verhogen gevoeligheid voor TNF
Helaas hebben vooralsnog weinig patiënten langdurig baat bij immuuncheckpointremmers: tumorcellen zijn of worden vaak ongevoelig voor immuuncheckpointblokkade, en dat vraagt om additionele therapeutische targets. Een interessante strategie zou kunnen zijn om de gevoeligheid van tumorcellen voor cytotoxische T-cellen te verhogen. Cytokines als interferon-gamma (IFNγ) en tumornecrosefactor (TNF) dragen bij aan de antitumoreffecten van actieve T-cellen door de delingsactiviteit van tumorcellen te verlagen of zelfs celdood te induceren. Van defecten in de cellulaire signaleringsroute van IFNγ was al bekend dat ze tumorcellen resistent kunnen maken voor immuuncheckpointblokkade.
De groep van Daniel Peeper heeft nu met behulp van genoombrede CRISPR-Cas9-screening systematisch gezocht naar andere resistentiemechanismen, en nog belangrijker: of weerbarstige tumorcellen door een nieuwe interventie weer gevoelig gemaakt kunnen worden voor immunotherapie. Dat leverde diverse hits op die zowel melanoom- als longkankercellen gevoeliger bleken te maken voor T-cellen.
Met name inactivering van het gen dat codeert voor TNF-Receptor-Associated Factor-2 (TRAF2) maakte tumoren veel gevoeliger voor T-cellen. Omdat het verschillende signalen afgeeft kan TNF tumorcellen zowel stimuleren als remmen; het TRAF2-gen draagt bij aan de stimulatie. Door TRAF2 te inactiveren blijft alleen het tumordodende effect van TNF over en wordt de drempel voor TNF-cytotoxiciteit verlaagd. Bovendien reageerden muizen met resistente tumoren er beter door op immunotherapie.
Wat de onderzoekers bij patiënten zagen is dat de niveaus van TNF in de tumor vaak heel laag zijn. De gedachte is dat door TRAF2 te inactiveren, tumoren zelfs voor die lage hoeveelheden TNF gevoeliger worden. Dit alles biedt hoop op de ontwikkeling van therapeutische mogelijkheden om te komen tot langduriger responsen van immuuncheckpointblokkade.2